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随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展,转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中,其应用越来越广泛。


本文将从多方面来深度解读细胞转染技术及一系列注意事项!


细胞转染是指将外源分子导入真核细胞内以改变其基因型或表型能力的一种技术。转染的主要目的是研究基因的功能或基因产物,通过增强或抑制特定基因在细胞中的表达,并在哺乳细胞中产生重组蛋白。


转染根据是否能把外源核酸整合到宿主染色体上分为瞬时转染稳定转染



瞬时转染:外源性DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一次宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但是通常只能维持几天,多用于启动子以及其他调控元件的分析。一般在24-96小时内分析结果。核酸类型比较广泛,质粒DNA、siRNA、miRNA、和mRNA都可进行瞬时转染。


稳定转染:通过这种转染方式外源性DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体存在。外源DNA整合到宿主染色体中概率很小,大约1/10000转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,得到稳定转染的同源细胞系。稳定转染的核酸多为质粒DNA。


细胞转染方法挺多的,该如何选择呢?莫急,且看小优将细胞转染常用的技术及其优缺点给您娓娓道来。

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细胞转染实验大battle


常用的转染方法有以下几种:

物理介导:电穿孔法、显微注射和基因枪

化学介导:磷酸钙共沉淀法、阳离子聚合物法和脂质体转染方法

生物介导:病毒介导法



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物理介导法


1.电穿孔法


电穿孔是通过高强度的电场作用破坏细胞膜电位,瞬时提高细胞膜的通透性,从而吸收周围介质中的外源分子。


电穿孔法可适用于所有细胞类型的瞬时和稳定转染,但是其高电压脉冲导致细胞致死率非常高,并且对DNA和细胞的用量很大。


这个缺点不仅没有让这项技术就此没落,还促进了它更好的发展。


1998年,市场上第一个有效的、非病毒介导的Nucleofector™ 技术开发成功,可高效转染传统方法难以转染的原代细胞,干细胞,神经元和细胞系,为疾病研究治疗如基因治疗,免疫治疗和干细胞生成开发带来了新的机遇。


Nucleofector™技术是Lonza公司的专利创新技术,是一种改进的电穿孔技术,利用电击在细胞膜上开个小孔,综合各种特定细胞转染程序与转染液的作用,核酸底物不仅可以进入细胞质,还可直接通过核膜进入细胞核。这使得细胞最高转染可达99%,而且实现转染不依赖于细胞的分裂。


Nucleofector™技术优势

① 质粒DNA的转染效率高达90%,siRNA的转染效率高达99%。


② 极好的保存转染细胞的生理状态和活力。


③ 转染后不久即可进行转染分析。


④ 拥有650多种细胞类型特定方案,可直接进行转染。


⑤ 转染底物包括DNA,mRNA,miRNA,siRNA,肽或蛋白质。


⑥ 转染难以转染的细胞,包括原代细胞,干细胞,神经元和细胞系,以及贴壁细胞。


⑦ 文献引用量达8000+篇


⑧ 使用一次性无菌Nucleocuvette™容器降低交叉污染的风险


⑨ 不同的Nucleofector™平台具有灵活的扩展功能,设备平台之间条件的轻松转移,扩展您的研究。


优点很多,唯一的缺点是需特殊仪器设备

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Nucleofection™技术组件:

① Nucleofector™设备,包括针对每种优化的细胞类型进行预编程的独特电参数,可将底物直接递送至细胞核和细胞质。不同的平台针对各种应用提供了不同的规格。


② Nucleofector™套件,包含专用的Nucleofector™解决方案和所需试剂耗材。这些充当高转染效率和细胞生存力的保护环境,同时保持生理相关的细胞状况。还提供了指定的Nucleofection容器,移液管和荧光阳性对照载体(pmaxGFP™对照载体)。


③ 优化的方案可为最佳核转染条件提供全面指导,并提供细胞来源,传代,生长条件和培养基以及转染后培养的技巧。


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2.显微注射法


需要使用精密的仪器,直接将外源性核酸注射至宿主细胞核内。多用于转基因,由宿主基因组序列可能发生的重组,缺失,复制或者异位等现象使外源基因嵌入宿主的染色体中。


但是转染细胞数有限,多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞。


3.基因枪法


又名生物弹道技术(Biolistic Technology),用压缩气体(氦或氮等) 动力产生一种冷的气体冲击波进入轰击室,把粘有DNA 的细微金粉打向细胞,穿过细胞壁、细胞膜、细胞质等层层构造到达细胞核,完成基因转移。


该方法可用于人的表皮细胞,纤维原细胞,淋巴细胞系以及原代细胞,不易毒害细胞,但是转化效率较低。



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化学介导法


1.磷酸钙共沉淀法


借助于形成一种DNA-磷酸钙复合物沉淀黏附在细胞膜表面,通过细胞的内吞作用而使DNA被细胞捕获。沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要,也受pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、细胞孵育时间等因素影响。


可适用于稳转瞬转,操作简便花费相对较低,但转染效率低,10-20%,并且重复性很差。


2.阳离子聚合物法


带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用,并通过内吞作用进入细胞。


具有阳离子脂质体的转染效率高,操作简单,适用范围广,重复性好等特点外,还具有在体内转染效率高,细胞毒性低等特点。


3.脂质体转染方法


带正电的脂质体与带负电的核酸磷酸基团形成DNA-阳离子脂质体复合物,再与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合,可能经过内吞作用被导入细胞。


该方法使用简单,可携带大片段DNA,通用于各种类型的裸露DNA或RNA,能转染各种类型的细胞,转染效率、转染的稳定性和可重复性大大提高。但转染时需要去除血清,血清的缺失会导致细胞毒性增加;转染效果也随细胞类型变化大。


实验步骤:

❤ 在单独试管中分别稀释核酸及转染试剂;

❤ 脂质体与核酸的磷酸骨架结合,形成复合物;

❤ 脂质体上的正电荷有助于复合物与细胞膜结合;复合物通过内吞作用进入胞浆;

❤ 分析细胞瞬时基因表达或沉默情况。


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03

生物介导法


病毒介导法


病毒介导法转染效率特别高,尤其是难以转染的原代细胞、活体细胞,同时具有细胞毒性很低的优势。但是,病毒转染方法的准备程序复杂,构建病毒周期长,环节多,易出错,费用也高,常常对细胞类型有很强的选择性,在一般实验室中很难普及。


1.逆转录病毒(RNA)

通过病毒侵染宿主细胞的机制将外源基因整合到宿主细胞的染色体中,导致基因失活或激活癌基因,构建稳转株。可以用于难转染的细胞,原代细胞,体内细胞等,但携带基因不能太大(<8kb),,需考虑安全因素。


2.腺病毒(双链DNA)

腺病毒除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中,因此不会干扰其它的宿主基因。瞬时表达,可以包装8kb左右外源基因,转染较容易,但是转染效率不高。


实验步骤:

❤ 通过基因克隆生成重组病毒

❤ 采用非病毒法转染包装细胞系,扩增并分离得到重组病毒颗粒

❤ 纯化并滴定病毒液

❤ 转导目的细胞(含有病毒特异性的受体)

❤ 去除培养物中的病毒,并加入新鲜培养基

❤ 分析细胞瞬时基因表达或沉默情况


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04

注意事项



核酸质量

DNA:内毒素会导致转染效率显著下降,特别是对内毒素敏感细胞比如原代细胞、悬浮细胞和造血细胞或者想要获得最高的转染效率和最低的细胞毒性,因此最好选择内毒素含量较低的质粒抽提试剂盒。


siRNA: 需合理的计算siRNA的浓度,过多的siRNA会导致细胞毒性甚至死亡。


细胞质量

细胞密度:不同的转染试剂,对细胞密度的要求不尽相同。在进行不同核酸或不同细胞系的转染时,需要根据说明书再次优化实验条件。


细胞状态:不同细胞使用不同的培养基,血清和其他添加物。高的转染效率需要细胞保持良好的状态,通常在转染前24小时分细胞,这能够提供正常细胞代谢,增加对外源DNA摄入的可能。除此之外,要保证避免细菌,支原体或真菌的污染。


转染方法及转染试剂

根据所转染细胞及底物选择适合的转染方法及转染试剂。理想的细胞转染应该是转染效率高;毒性低;方法简单;省时省力。


其实无论采用哪种转染技术,要获得最优的转染结果,可能都需要对转染条件进行优化(也可以选择优化好的试剂盒)。影响转染效率的因素远不止上述提到的这些,从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态,质粒的大小以及转染方法的操作细节等等,都可能影响到最终的实验结果。如果有高品质的优化好的操作方案及试剂盒,那就果断选择,相信会事半功倍的。最后希望大家都有一个满意的转染结果。



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